Semana 4

En la cuarta semana hicimos un ensayo in vivo, el cual consistía:

A 4 ratones machos se les inyecta 25 ug/0.1 ml de LPS por vía intraperitoneal

Luego a dos de esos ratones se los deja 6 horas, se los mata y se les saca los macrófagos, luego se ponen en una placa con medio de cultivo al 10 % de suero fetal bobino y se los deja pegándose a la placa durante 2 horas, luego se lava y se cambia el medio con 5 % de suero fetal bobino. Luego se los deja 24 horas.

Los otros 2 ratones se los dejo 24 horas (a diferencia de 6 horas) y se repite el procedimiento de pegado y limpiado. También se dejan encubar 24 horas.


Luego de que se cumplen las 24 horas de cada una de las placas, se obtienen el sobrenadante, el cual se utiliza para ver que liberan los macrófagos cuando al animal se los induce con LPS (con el sobrenadante se puede averiguar la concentración de nitritos).
También, con los macrófagos que quedan en la placa, se lisan con un buffer de lisis y se puede observar que proteínas expresan los macrófagos de animales estimulados con LPS.

Tanto el sobrenadante como el lisado se cuantifico la concentración de proteínas por el método de Bradford para luego ser usados con un Western Blot.

Las concentraciones obtenidas fueron:

• Ratón de control:

Sobrenadante: 2.8 mg/ml
Lisado:2.23 mg/ml

• Los ratones que incubaron 6 horas:

Sobrenadante: 2.72 mg/ml
Lisado:2.47 mg/ml

• Los ratones incubados 24 horas:

Sobrenadante: 2.47 mg/ml
Lisado:2.44 mg/ml

Luego de terminar con esta practica, la investigadora nos mostró como era el proceso de descongelamiento de una linea celular de carcinoma mamario humano (MCF-7), dichas células están previamente congeladas en un crío tubo en nitrógeno liquido a -170ºC. Este crío tubo con la células luego se sacarlas con extremo cuidado del nitrógeno liquido, se los coloca en agua tibia (para un descongelado rápido), luego se pasa a un frasco de cultivo(T-25) con medio de cultivo (F-12) a 10% de suero fetal bobino , y para finalizar se las coloca en una estufa a 37ºC ( temperatura del cuerpo humano) con 5%de CO2, (para la duplicación de las mismas para ser utilizadas en un futuro).