El LPS (lipopolisacárido) es una endotoxina derivada de las paredes celulares de bacterias gramnegativas con actividades inflamatoria.
Por lo tanto comenzaremos analizando y estudiando a los macrófagos (que son células fagocíticas de gran tamaño derivada del monocitos sanguíneos y que también actúan como células presentadoras de antígeno además de limpiar y reparar un tejido dañado) para ver si estos son capaces de formar nuevos vasos sanguíneos al ser estimulados con LPS 100 mg/ml. El LPS se une a un receptor denominado Receptor de tipo Toll (RTT) expresado en los macrófagos y de esta manera activa a dicha célula a expresar y secretar diferentas molecular. La alta concentración de LPS es tóxica.
Para esto, primero obtuvimos los macrófagos peritoneales de la siguiente manera:
Trabajamos con ratones, los cuales primero se los durmió en un frasco con éter y luego mueren por asfixia. Posteriormente abrimos al animal, sin romper el peritoneo (tejido que recubre los órganos del abdomen) e inyectamos intraperitonealmente 5 ml de medio de cultivo con suero fetal bovino al 10%. Luego con la misma aguja retiramos el medio, a su vez podemos ayudarnos en la extracción con una pipeta Pasteur y de esta manera obtenemos las células peritoneales que no solo son macrófagos si no que también hay linfocitos, neutrófilos, etc. Estas células las colocamos en 4 placas de Petri y las dejamos 2 hs en la estufa de cultivo a 37ºC para que los macrófagos se adhieran mientras que el resto de las células no. Sí, podemos afirmar que el 95% de las células pegadas son macrófagos. Para evitar contaminación siempre trabajamos con un mechero.
Luego de haber esperado las 2 hs en la estufa, tomamos la placa y descartamos el medio de cultivo y realizamos 2 lavados con PBS (solución compuesta por Fosfato de Na, Difosfato de Na, Cloruro de Sodio), cuyo objetivo es extraer las células que no eran macrófagos. Luego a las placas se les coloca medio nuevo al 5% de suero fetal bovino. De las 4 placas de Petri, a 2 las tratamos con LPS 100 mg/ml y el resto las usamos como control.
Al día siguiente, luego de 24 hs., levantamos los macrófagos de la placa de petri con un scraper y los contamos con la "cámara de Neubauer" para saber cuantos macrófagos tenemos. Posteriormente se realizó el ensayo de angiogénesis in vivo, que consiste en inocular ratones Balb/c, por vía intradérmica, en ambos flancos con 300.000 o 500.000 macrófagos estimulados o no con LPS, los cuales habíamos obtenidos de las placas de Petri. Luego de 5 días, los animales se sacrifican con éter y se separa por disección la piel de los tejidos adyacentes. La respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección WILD. El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm2 de piel. Para ello se fotografiaron los sitios de inoculación, se proyectan sobre una cuadricula y se contó el número total de vasos. La densidad de vasos se determina por la fórmula:
Nº de vasos/mm2 = S nº de vasos en cada cuadrado / nº total de cuadrados
El jueves entrante continuaremos aprendiendo más. Y les comentaremos todo lo aprendido.
Inyectando el medio para la obtencíon de macrófagos
Extrayendo el medio con macrófagos y células peritoneales (Utilizamos la Pipeta Pasteur)
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