En las semanas siguientes empezaremos con las practicas de Inmunotransferencia o también llamada Western Blot, la cual se utiliza para determinar la cantidad relativa y el peso molecular de una proteína en una mezcla de proteínas u otras moléculas. Estas proteínas se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida, de forma que las posiciones finales de las distintas proteínas en el gel depende del tamaño de las moléculas. A continuación, se transfiere el conjunto de proteínas separadas desde el gel de poliacrilamida de separación a una membrana soporte de nitrocelulosa mediante acción capilar o electroforesis, lo que hace es que la membrana adquiera una replica del conjunto de macromoléculas separadas existentes en el gel. Una vez realizada la transferencia, a la membrana se la trata con el 1er anticuerpo especifico para el antígeno o proteína de interés, se lo deja toda la noche a 4ºC y al día siguiente, se hacen lavados con una solución llamada TBS-Tween. Finalmente se incuba la membrana con el 2do anticuerpo unido a una enzima denominada Peroxidasa la cual al colocarle su sustrato permite identificar la presencia de la protreina específica por medio de una reacción quimioluminiscente. Esta reacción ocurre cuando la energía de una reacción química se emite en forma de luz. Se emplea la peroxidasa de rábano (HRP) para catalizar la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediatamente después de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas. Esta reacción se produce sobre una membrana en contacto con una película de autorradiografía ésta queda impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios ('striping') y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos ('reprobing').
En este día haremos la preparación de los geles. El gel concentrador contiene, H2O (d), TRIS HCl 0,5M pH 6.8, SDS 10%, acrilamida es el gelificante, presulfato de amonio y Temed que son los catalizadores para que gelifique la acrilamida. El gel separador contiene, H2O (d), TRIS HCl 1.5M pH 8.8, SDS 10% el cual desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente, acrilamida es el gelificante, presulfato de amonio y Temed que son los catalizadores para que gelifique la acrilamida. Las muestra que se cargan en el gel se tratan con una solución que se llama Sample Buffer que contiene SDS el cual desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente, b-Mercaptoetanol que rompe puentes disulfuros y azul bromofenol que es un colorante que me permite ver el frente de corrida en el gel. Una vez hecha la electroforesis de las muestras trataremos de identificar la expresión de diferentes proteínas como MMP-9, VEGF-A y CD-31, estas ultimas son consideradas marcadores angiogenicos.
Contenido del gel.
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