Semana 6

En nuestra 6ta semana de pasantía, continuando con el eje central del objetivo de la investigación, que consiste en la formación de vasos sanguíneos a partir de otros ya existentes (angiogénesis) en un modelo de inflamación aguda inducido por LPS.


Los miocardiocitos obtenidos la semana pasada fueron tratados con diferentes concentraciones de LPS 0,1 y 10 mg/ml, estas estimulaciones fueron realizadas por duplicados. Dichas células fueron dejadas 24 hs en medio de cultivo (volumen final: 1 ml) al 5% de suero fetal bovino con el estimulo o no (Control o Basal). Una vez pasado dicho tiempo, se obtienen los sobrenadantes por un lado y por otro se lisan las células con un buffer de lisis. De esta manera esperamos verificar si los miocardiocitos son capaz de estimularse, para luego realizar diferentes mediciones: Nitritos, expresión de proteínas por western blot, prostaglandinas.


A los sobrenadantes y lisados celulares se le midieron las proteínas por Bradford, cuyo resultado fue el siguiente:










En nuestra segunda parte de la jornada trabajamos los resultados de la Angiogénesis in vivo realizada la segunda semana de pasantía.
Recordemos que este consistía en inocular ratones Balb/c, por vía intradérmica, en ambos flancos con 300.000 o 500.000 macrófagos estimulados o no con LPS, los cuales habíamos obtenidos de las placas de Petri (Ver Semana 2). Luego de 5 días, los animales se sacrifican con éter y se separa por disección la piel de los tejidos adyacentes.
La respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección llamado WILD.
El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm2 de piel. Para ello se tomaron fotografías las cuales las analizaremos a continuación. (puedes agrandar imágenes clikeando sobre las mismas)


Control (Basal)
Imagen de vasos sanguíneos sin tratamiento alguno.


Imagen de Vasos Sanguíneos 300000 Macrófagos sin ser estimulados con LPS

Imagen de Vasos Sanguíneos 300000 Macrófagos estimulados con LPS

Claramente sin realizar cuentas podemos analizar a simple vista que los Macrófagos al ser estimulados con LPS se logra Obtener mayor cantidad de Vasos Sanguíneos en comparaciòn con con los Macrofágos sin estimulación.




Imagen de Vasos Sanguíneos 500000 Macrófagos sin ser estimulados con LPS

Imagen de Vasos Sanguíneos 500000 Macrófagos estimulados con LPS

Comparando ahora la estimución a distintas concentraciones
Analizando a simple vista, sin realizar cálculos, podemos ver que los Macrófagos al ser estimulados con LPS se logra Obtener mayor cantidad de Vasos Sanguineos en comparación con con los Macrofágos sin estimulación.
A continuación les presentamos los resultados numéricos luego de haber sido contabilizados las diapositivas sobre la cuadricula, los cuales se expresan como nro. de vasos/mm2



Véase imagen correctamente, haciendo click sobre la misma.


Conclusiones:
De esta manera podemos ver que que el número de vasos promedio por mm2 es mayor en comparación cuando lo estimulamos con LPS que cuando no es estimulado.
Y el numero de vasos promedio por mm2 es mayor cuando trabajamos a 300000 mfs ESTIMULADOS CON LPS que cuando los hacemos con 500000 mfs ESTIMULADOS CON LPS.