Semana 4

En la cuarta semana hicimos un ensayo in vivo, el cual consistía:

A 4 ratones machos se les inyecta 25 ug/0.1 ml de LPS por vía intraperitoneal

Luego a dos de esos ratones se los deja 6 horas, se los mata y se les saca los macrófagos, luego se ponen en una placa con medio de cultivo al 10 % de suero fetal bobino y se los deja pegándose a la placa durante 2 horas, luego se lava y se cambia el medio con 5 % de suero fetal bobino. Luego se los deja 24 horas.

Los otros 2 ratones se los dejo 24 horas (a diferencia de 6 horas) y se repite el procedimiento de pegado y limpiado. También se dejan encubar 24 horas.


Luego de que se cumplen las 24 horas de cada una de las placas, se obtienen el sobrenadante, el cual se utiliza para ver que liberan los macrófagos cuando al animal se los induce con LPS (con el sobrenadante se puede averiguar la concentración de nitritos).
También, con los macrófagos que quedan en la placa, se lisan con un buffer de lisis y se puede observar que proteínas expresan los macrófagos de animales estimulados con LPS.

Tanto el sobrenadante como el lisado se cuantifico la concentración de proteínas por el método de Bradford para luego ser usados con un Western Blot.

Las concentraciones obtenidas fueron:

• Ratón de control:

Sobrenadante: 2.8 mg/ml
Lisado:2.23 mg/ml

• Los ratones que incubaron 6 horas:

Sobrenadante: 2.72 mg/ml
Lisado:2.47 mg/ml

• Los ratones incubados 24 horas:

Sobrenadante: 2.47 mg/ml
Lisado:2.44 mg/ml

Luego de terminar con esta practica, la investigadora nos mostró como era el proceso de descongelamiento de una linea celular de carcinoma mamario humano (MCF-7), dichas células están previamente congeladas en un crío tubo en nitrógeno liquido a -170ºC. Este crío tubo con la células luego se sacarlas con extremo cuidado del nitrógeno liquido, se los coloca en agua tibia (para un descongelado rápido), luego se pasa a un frasco de cultivo(T-25) con medio de cultivo (F-12) a 10% de suero fetal bobino , y para finalizar se las coloca en una estufa a 37ºC ( temperatura del cuerpo humano) con 5%de CO2, (para la duplicación de las mismas para ser utilizadas en un futuro).

semana 3

Medición de prot. por Bradford de homogenatos de piel de animales inoculados con Mfs+LPS y miocar.


En la tercer semana medimos la concentración de proteínas en la piel de los ratones por el método de Bradford, el cual consistía en el trazado de una curva de calibración con albumina con un espectrofotmetro, pero antes obtubimos las proteínas y para esto se hacia el homogenato a partir de una capa delgada de la piel interna del animal. Luego ,se traza la curva de calibración para poder hubicar nuestras muestras en la curva segun su concentracion. Ttomamos 5, 10 , 15 y 20 micro litros de albumina 1mg/ml y se los llevaba a 50 micro litros de agua, se le agregaban 950 micro litros del reactivo de Bradford y se leían en un espectrofotometro a 595 nm, los resultado de la curva fueron:











Después tomamos nuestras muestras del homogenatos en concentración de 300.000 Macrofagos o 500.000 Macrofagos en 0,1 ml de medio estimulados o no con LPS. Tambien hubo un animal control al cual no se le inocularon celulas.





Luego sacamos la concentración de proteínas en nuestras muestras mediante una tabla de Exel

semana 2 29/05/08

Durante nuestro segundo día de pasantía pudimos profundizar los objetivos que se proponen en la investigación: la formación de vasos sanguíneos a partir de otros ya existentes (angiogénesis) en un modelo de inflamación aguda inducido por LPS.

El LPS (lipopolisacárido) es una endotoxina derivada de las paredes celulares de bacterias gramnegativas con actividades inflamatoria.
Por lo tanto comenzaremos analizando y estudiando a los macrófagos (que son células fagocíticas de gran tamaño derivada del monocitos sanguíneos y que también actúan como células presentadoras de antígeno además de limpiar y reparar un tejido dañado) para ver si estos son capaces de formar nuevos vasos sanguíneos al ser estimulados con LPS 100 mg/ml. El LPS se une a un receptor denominado Receptor de tipo Toll (RTT) expresado en los macrófagos y de esta manera activa a dicha célula a expresar y secretar diferentas molecular. La alta concentración de LPS es tóxica.
Para esto, primero obtuvimos los macrófagos peritoneales de la siguiente manera:
Trabajamos con ratones, los cuales primero se los durmió en un frasco con éter y luego mueren por asfixia. Posteriormente abrimos al animal, sin romper el peritoneo (tejido que recubre los órganos del abdomen) e inyectamos intraperitonealmente 5 ml de medio de cultivo con suero fetal bovino al 10%. Luego con la misma aguja retiramos el medio, a su vez podemos ayudarnos en la extracción con una pipeta Pasteur y de esta manera obtenemos las células peritoneales que no solo son macrófagos si no que también hay linfocitos, neutrófilos, etc. Estas células las colocamos en 4 placas de Petri y las dejamos 2 hs en la estufa de cultivo a 37ºC para que los macrófagos se adhieran mientras que el resto de las células no. Sí, podemos afirmar que el 95% de las células pegadas son macrófagos. Para evitar contaminación siempre trabajamos con un mechero.
Luego de haber esperado las 2 hs en la estufa, tomamos la placa y descartamos el medio de cultivo y realizamos 2 lavados con PBS (solución compuesta por Fosfato de Na, Difosfato de Na, Cloruro de Sodio), cuyo objetivo es extraer las células que no eran macrófagos. Luego a las placas se les coloca medio nuevo al 5% de suero fetal bovino. De las 4 placas de Petri, a 2 las tratamos con LPS 100 mg/ml y el resto las usamos como control.
Al día siguiente, luego de 24 hs., levantamos los macrófagos de la placa de petri con un scraper y los contamos con la "cámara de Neubauer" para saber cuantos macrófagos tenemos. Posteriormente se realizó el ensayo de angiogénesis in vivo, que consiste en inocular ratones Balb/c, por vía intradérmica, en ambos flancos con 300.000 o 500.000 macrófagos estimulados o no con LPS, los cuales habíamos obtenidos de las placas de Petri. Luego de 5 días, los animales se sacrifican con éter y se separa por disección la piel de los tejidos adyacentes. La respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección WILD. El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm2 de piel. Para ello se fotografiaron los sitios de inoculación, se proyectan sobre una cuadricula y se contó el número total de vasos. La densidad de vasos se determina por la fórmula:

Nº de vasos/mm2 = S nº de vasos en cada cuadrado / nº total de cuadrados









El jueves entrante continuaremos aprendiendo más. Y les comentaremos todo lo aprendido.







Inyectando el medio para la obtencíon de macrófagos








Extrayendo el medio con macrófagos y células peritoneales (Utilizamos la Pipeta Pasteur)