Semana 10

En nuestra décima semana de Proyecto final (pasantías) el objetivo planteado por nuestra investigadora fue ver si existe contaminación de micoplasma en una linea celular MCF-7. El micoplasma es un genero microbiano de bacterias que carecen de una pared celular, y debido a esta condición de carencia de pared celular, no se ven afectadas por algunas antibioticos como la penicilina. Estas bacterias infectan el citoplasma de la célula.
La técnica a utilizar para el control del micoplasma se denomina: HOECHST. El cual consiste en la utilización de un colorante fluorescente denominado Bisbenzimida que se intercala en el ADN.

La técnica se realiza de la siguiente manera:

1- Sembrar las células sobre cubreobjetos; colocados en una caja de petri; en su medio habitual.

2- Incubar a 37°C en estufa gaseada 5% CO2 en aire hasta llegar a una confluencia del 70% aproximadamente.

3- 3 Lavados con PBS

4- Fijar los preparados con fijador "camoy" (Metanol + Ácido Acético) por 5 minutos.

5- Descartar fijador y dejar secar al aire.

6- Colorear 30 min en oscuridad con Bisbenzimida 5M

7- 3 lavados con PBS 10 min.

8- Observamos el resultado en el Microscopio.

Los resultados que se podrían esperar son:

Positivo: el colorante tiñe el ADN de la célula y el ADN de la bacteria, observandose el núcleo de la célula y un puntillado en el citoplasma, que corresponde a la contaminación con micoplasma.

Negativo: el colorante tiñe solamente el ADN de la célula y el citoplasma no se observa.

Nuestros resultados fueron positivos, por lo que las células fueron desechadas.

¡FELICES VACACIONES.!

Semana 9

En esta semana hicimos las calles del western blot. Teniamos 10 calles debido a que previamennte habíamos utilizado un peine de 8 dientes, quien logro separar el gel en 10 partes.
De esta manera hicimos las calles, sembrando los siguiente en cada una de las calles:
OBJETIVO: Buscamos Metealoproteasa MMP-9

Calle 1:-SD- MFS con LPS (Control)
Calle 2:Marcador Molecular
Calle 3:-SD- MFS sin LPS
Calle 4:-SD- MFS con LPS
Calle 5:-SD- Miocardiocitos
Calle 6:-SD- Miocardiocitos concentrados
Calle 7:-SD-Miocardiocitos "el resto" del filtrado
Calle 8:Control (+)
Calle 9:Idem 5
Calle 10:Idem 6


calle 1:-SD- 24hs (Control)
calle 2:Marcador Molecular
calle 3:-LIS-COntrol
calle 4:-LIS-MFS 6hs
calle 5:-LIS-MFS 24hs
calle 6:-SD- Control
calle 7:-SD-MFS 6hs
calle 8:-SD-MFS 24hs
calle 9:Control (+)
calle 10:Idem 4

Obsercaciones: las puntas(calles 1; 10) no siempre salen bien; estas no llevan anticuerpo

- SD - Sobrenadante - LIS- Lisado
Primer anticuerpo reconoce las proteínas

Segundo anticuerpo reconoce otro anticuerpo (el revelado sale mal)

Resultado: Al llegar al revelado, todo lo que se revela es por presencia del primer anticuerpo, en caso de aparecer revelado algo en el control esta mal.

El segundo que hicimos fue sobre HOMOGENATOS DE PIELES DE ANIMALES
OBJETIVO: Buscamos MMP-9
HM: Homogenatos

Calle 1:Idem 6
Calle 2:Marcador
Calle 3:-HM-
Calle 4: Piel Inoculamos 300000 MFS sin LPS
Calle 5: Piel Inoculamos 300000 MFS con LPS
Calle 6: Piel Inoculamos 500000 MFS sin LPS
Calle 7: Piel Inoculamos 500000 MFS con LPS
Calle 8:-HM- Corazon
Calle 9: Idem 7
Calle 10: Idem 8

Calle 1:
Calle 2:Marcador
Calle 3:-HM- Control
Calle 4: Piel 300000 Miocardiocitos
Calle 5: Piel 500000 Miocardiocitos
Calle 6: Piel 1000000 Miocardiocitos
Calle 7: -HM- Tumor 14 días
Calle 8: Idem 5
Calle 9: Idem 6
Calle 10: Idem 7

Así son las calles.

Semana 8

En esta semana seguimos con los ensayos de inmunotransferencia, en este caso hicimos la siembra de las proteínas y la corrida electroforetica, con el objetivo de buscar la metaloproteasa MMP-9.

En el primer gel sembramos:SB de MFS con LPS(control), marcador molecular, SB de MFS sin LPS, SB de miocardiocitos, SB miocardiocitos a mas [c], SB de miocardiocitos del filtrado y un control positivo

En el segundo gel sembramos: SD 24hs, marcador molecular, Lis MFS control, Lis MFS 6hs, Lis MFS 24hs, SD control; SD MFS 6hs, SD MFS 24 hs, control positivo

En las calles de las puntas se hacen control sin anticuerpos, debido a que no siempre salen bien, y es mejor perder un control que una muestra, aparte todo lo que se revela es por presencia del primer anticuerpo, si aparece revelado algo en el control es inespecífico.

Semana 7

En las semanas siguientes empezaremos con las practicas de Inmunotransferencia o también llamada Western Blot, la cual se utiliza para determinar la cantidad relativa y el peso molecular de una proteína en una mezcla de proteínas u otras moléculas. Estas proteínas se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida, de forma que las posiciones finales de las distintas proteínas en el gel depende del tamaño de las moléculas. A continuación, se transfiere el conjunto de proteínas separadas desde el gel de poliacrilamida de separación a una membrana soporte de nitrocelulosa mediante acción capilar o electroforesis, lo que hace es que la membrana adquiera una replica del conjunto de macromoléculas separadas existentes en el gel. Una vez realizada la transferencia, a la membrana se la trata con el 1er anticuerpo especifico para el antígeno o proteína de interés, se lo deja toda la noche a 4ºC y al día siguiente, se hacen lavados con una solución llamada TBS-Tween. Finalmente se incuba la membrana con el 2do anticuerpo unido a una enzima denominada Peroxidasa la cual al colocarle su sustrato permite identificar la presencia de la protreina específica por medio de una reacción quimioluminiscente. Esta reacción ocurre cuando la energía de una reacción química se emite en forma de luz. Se emplea la peroxidasa de rábano (HRP) para catalizar la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediatamente después de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas. Esta reacción se produce sobre una membrana en contacto con una película de autorradiografía ésta queda impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios ('striping') y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos ('reprobing').
En este día haremos la preparación de los geles. El gel concentrador contiene, H2O (d), TRIS HCl 0,5M pH 6.8, SDS 10%, acrilamida es el gelificante, presulfato de amonio y Temed que son los catalizadores para que gelifique la acrilamida. El gel separador contiene, H2O (d), TRIS HCl 1.5M pH 8.8, SDS 10% el cual desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente, acrilamida es el gelificante, presulfato de amonio y Temed que son los catalizadores para que gelifique la acrilamida. Las muestra que se cargan en el gel se tratan con una solución que se llama Sample Buffer que contiene SDS el cual desnaturaliza las proteínas y las carga negativamente, b-Mercaptoetanol que rompe puentes disulfuros y azul bromofenol que es un colorante que me permite ver el frente de corrida en el gel. Una vez hecha la electroforesis de las muestras trataremos de identificar la expresión de diferentes proteínas como MMP-9, VEGF-A y CD-31, estas ultimas son consideradas marcadores angiogenicos.





Contenido del gel.

Videos - Semana 5

Para complementar las imagenes del cultivo primario de miocardiocitos, les presentamos algunos videos del cultivo que reproducen los resultados obtenidos en el microscopio.

Esperamos que lo disfruten.

Semana 6

En nuestra 6ta semana de pasantía, continuando con el eje central del objetivo de la investigación, que consiste en la formación de vasos sanguíneos a partir de otros ya existentes (angiogénesis) en un modelo de inflamación aguda inducido por LPS.


Los miocardiocitos obtenidos la semana pasada fueron tratados con diferentes concentraciones de LPS 0,1 y 10 mg/ml, estas estimulaciones fueron realizadas por duplicados. Dichas células fueron dejadas 24 hs en medio de cultivo (volumen final: 1 ml) al 5% de suero fetal bovino con el estimulo o no (Control o Basal). Una vez pasado dicho tiempo, se obtienen los sobrenadantes por un lado y por otro se lisan las células con un buffer de lisis. De esta manera esperamos verificar si los miocardiocitos son capaz de estimularse, para luego realizar diferentes mediciones: Nitritos, expresión de proteínas por western blot, prostaglandinas.


A los sobrenadantes y lisados celulares se le midieron las proteínas por Bradford, cuyo resultado fue el siguiente:










En nuestra segunda parte de la jornada trabajamos los resultados de la Angiogénesis in vivo realizada la segunda semana de pasantía.
Recordemos que este consistía en inocular ratones Balb/c, por vía intradérmica, en ambos flancos con 300.000 o 500.000 macrófagos estimulados o no con LPS, los cuales habíamos obtenidos de las placas de Petri (Ver Semana 2). Luego de 5 días, los animales se sacrifican con éter y se separa por disección la piel de los tejidos adyacentes.
La respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección llamado WILD.
El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm2 de piel. Para ello se tomaron fotografías las cuales las analizaremos a continuación. (puedes agrandar imágenes clikeando sobre las mismas)


Control (Basal)
Imagen de vasos sanguíneos sin tratamiento alguno.


Imagen de Vasos Sanguíneos 300000 Macrófagos sin ser estimulados con LPS

Imagen de Vasos Sanguíneos 300000 Macrófagos estimulados con LPS

Claramente sin realizar cuentas podemos analizar a simple vista que los Macrófagos al ser estimulados con LPS se logra Obtener mayor cantidad de Vasos Sanguíneos en comparaciòn con con los Macrofágos sin estimulación.




Imagen de Vasos Sanguíneos 500000 Macrófagos sin ser estimulados con LPS

Imagen de Vasos Sanguíneos 500000 Macrófagos estimulados con LPS

Comparando ahora la estimución a distintas concentraciones
Analizando a simple vista, sin realizar cálculos, podemos ver que los Macrófagos al ser estimulados con LPS se logra Obtener mayor cantidad de Vasos Sanguineos en comparación con con los Macrofágos sin estimulación.
A continuación les presentamos los resultados numéricos luego de haber sido contabilizados las diapositivas sobre la cuadricula, los cuales se expresan como nro. de vasos/mm2



Véase imagen correctamente, haciendo click sobre la misma.


Conclusiones:
De esta manera podemos ver que que el número de vasos promedio por mm2 es mayor en comparación cuando lo estimulamos con LPS que cuando no es estimulado.
Y el numero de vasos promedio por mm2 es mayor cuando trabajamos a 300000 mfs ESTIMULADOS CON LPS que cuando los hacemos con 500000 mfs ESTIMULADOS CON LPS.

Semana 5

En nuestra 5ta semana de pasantía realizamos un cultivo primario de miocardiocitos (el cual lo podemos observar a la derecha de nuestra pantalla). El mismo consiste en la obtención de una célula a partir de un órgano como se el corazón. Utilizamos ratones de no más de 3 a 5 días de vida, a los cuales dentro de una campana, obtuvimos el corazón, colocándolo en una placa de Petri con un buffer previamente preparado que contenía: ClK + PO4H2k + ClNO + Fosfato ácido de Sodio + PO4HNa2
Se prepara este Buffer ya que con todas estas sales son las que logran que el corazón continué vivo.
Continuando con el práctico, se hicieron varios lavados con el buffer para poder quitar la sangre que el órgano desparramaba sobre la placa de Preti.
Luego trituramos los corazones dentro de la misma placa de Petri, que luego fueron colocados el un tubo falcon al cual se le agrego una solución de Tripsina, la cual es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos o aminoácidos de menor tamaño. La misma actúa a 37°C por eso llevamos el tubo dentro de un agitador a 37°C durante 15 min. La primera agitación elimina glóbulos rojos y sangre del corazón. Luego se realizan 4 lavados, cada uno con la solución de Tripsina, donde se obtienen las células del órganos en solución.
Obtenido el sobrenadante se centrifuga a 1000 RPM durante 4 min. donde se obtuvo un pellet de células que fueron colocadas en un frasco de cultivo donde se dejan adherir los fibroblastos quedando en el medio de cultivo: Los Miocardiocitos. Luego se sacan estas células y se la coloca en placas de 6 wells en medio de cultivo al 10% de SFB para que se adhieran y dividan. El medio se le cambia cada día por medio y antes de realizar el ensayo se le baja el % de suero al 5%.

Acá les compartiremos algunas imágenes vistas por nosotros en el microscopio del cultivo primario de miocardiocitos